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过氧乙酸对小瓜虫幼虫和包囊的杀灭效果

  (1.中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东广州510380;2.中国水产科学研究院,北京100141)

  摘要:采用过氧乙酸对4种主要养殖鱼类进行急性毒性试验,测试了过氧乙酸对小瓜虫幼虫和不同发育阶段包囊的杀灭效果。结果显示:过氧乙酸对斑点叉尾鮰、草鱼、奥尼罗非鱼,鲫鱼的安全浓度依次为1.73、3.00、3.57、5.20mg/L。过氧乙酸在浓度为6.250mg/L时.0.5h即能杀死全部小瓜虫幼虫:在1.562mg/L时,1h即能杀死全部幼虫。过氧乙酸对不同发育阶段的包囊都具有一定的杀灭效果,当过氧乙酸的浓度为6.250、3.125、1.562mg/L时,刚脱落的包囊的死亡率依次为75.63%、45.60%、25.60%,脱落2h的包囊的死亡率分别为64.23%、46.32%、20.20%,脱落10h的包囊的死亡率分别为65.86%、35.07%、10.20%。因此,过氧乙酸在较低的浓度范围内对小瓜虫的幼虫和包囊具有一定的杀灭效果。

  小瓜虫病是由小瓜虫(lchthyophthiriusmultifiliis)寄生于鱼的体表和鳃上引起的,最明显的症状是在鱼体表形成白点,因此又称“白点病”。小瓜虫的生活史包括3个阶段:自由游动的感染期幼虫、繁殖阶段的包囊和寄生于鱼体上的滋养体。对小瓜虫病的防治措施可以分为物理学方法、免疫方法和药物防治。物理学方法主要利用紫外线和通过增加水温等,虽然对小瓜虫病的防治有一定效果,但不适合在大水体中应用。小瓜虫的疫苗研究有组织疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗,但现在仍处于实验室研究阶段,短期内很难在生产上使用。目前,药物防治仍然是控制小瓜虫病的首选。国内外对小瓜虫病的药物进行了广泛的研究,分析了一些化学药物和中草药对小瓜虫的杀灭效果,但目前临床效果仍不理想,特别是对寄生于鱼的皮肤和鳃上的小瓜虫效果更差,难以替代硝酸亚汞、孔雀石绿等违禁药物的作用。过氧乙酸是一种高效消毒剂,属于过氧化物类,分解产物为乙酸、氧和水,无残留毒性,是一种环境友好型产品且具有快速、高效等优点,已广泛应用于医院、食品、医药、畜牧等领域,在水产养殖中也有一定应用。但是国内还未见氧乙酸对小瓜虫防治效果的详细报道。本研究进行了过氧乙酸对主要养殖品种的急性毒性试验,研究过氧乙酸对小瓜虫幼虫和不同发育阶段包囊的杀灭效果,以期为实际生产中采用过氧乙酸防治小瓜虫提供参考。

  试验采用净水停食试验法,试验容器为玻璃鱼缸(2000px×1000px×1000px),每缸放水100L。经预试验初步确定过氧乙酸使斑点叉尾鮰、鲫鱼、草鱼、奥尼罗非鱼存活的最高浓度和全部致死的最低浓度,再根据各种鱼的预试验结果按等比级数设个过氧乙酸浓度组(各设3个重复)及1个不加药液的空白对照组,每个处理放鱼20尾。每24h更换药液1次,观察记录各组试验鱼的行为、中毒症状及死亡等效应,试验时间为96h,计算过氧乙酸的LC50和安全浓度(SC):

  式中,Xm为最大剂量组剂量的对数值;I为相邻两组高剂量与低剂量之比的对数;P为各组死亡率。

  根据试验结果,设计5个浓度(6.250、3.125、1.562、0.780、0.390mg/L)过氧乙酸对小瓜虫幼虫和不同发育阶段包囊的杀灭试验。

  以斑点叉尾鮰为宿主,建立稳定的小瓜虫室内传代系统。挑选体格健壮、规格一致的斑点叉尾鮰,饲养在玻璃鱼缸(2000px×1000px×1000px)中,以曝气的自来水为水源,水温23(±1)℃。将患有小瓜虫病的斑点叉尾鮰与健康鱼混养在同一鱼缸中进行小瓜虫的鱼体传代,当鱼体表出现明显白点时,将大部分病鱼捞出,同时补充新的健康鱼继续传代小瓜虫。将严重感染小瓜虫的病鱼放在小缸(7L)中30min,通过孔径250、75μm的筛子过筛收集自由脱落的包囊。将收集的干净包囊分成两部分,一部分用于过氧乙酸杀灭不同发育阶段包囊的试验,另一部分继续23℃下培养18-20h即可收集幼虫。取5个10μL的幼虫液,用10%福尔马林杀死,置于显微镜下观察计数。用双蒸水将幼虫浓度调节至2个/μL,用于检测过氧乙酸对幼虫的杀灭效果。

  幼虫的杀灭试验在96孔组织培养板上进行,每孔先加入100μL不同浓度的过氧乙酸溶液,再加入100μL幼虫液(2个/μL),同时设置不加药液的空白对照组,每个处理3次重复。将组织培养板于倒置显微镜下观察,记录全部幼虫死亡所需的时间。如果药物能在1h内使全部的幼虫都停止游动贴于底板,并且虫体完全不动或仅是纤毛微微摆动,则证明幼虫全部被杀死,药物视为有效。试验重复3次。

  在24孔组织培养板上,测试过氧乙酸对刚脱落的包囊、脱落2h和10h的包囊的杀灭效果。收集包囊,调整为10个/mL悬液,每孔1mL包囊悬液,立即用移液器轻轻将水吸出或静置2h或10h后再将水吸出,然后再加入不同浓度的过氧乙酸溶液1mL。分别浸泡20h或18h或10h后,在倒置显微镜下观察,计数死亡的包囊。包囊缺少内核、纤毛不运动或未看见分裂,即认为包囊死亡。试验重复3次。

  试验数据用Statistica6.0软件进行统计分析,组间差异采用Duncan’s多重比较。

  由表2可知,过氧乙酸在6.250mg/L浓度时,0.5h即能杀死全部小瓜虫幼虫;在1.562mg/L浓度时,1即能杀死全部小瓜虫幼虫;当过氧乙酸浓度≤0.780mg/L时,在4h内都不能将小瓜虫幼虫全部杀死。可见,过氧乙酸对小瓜虫幼虫的杀灭具有明显的剂量一时间依赖性。

  过氧乙酸对不同发育阶段包囊都具有一定的杀灭效果(表3)。在杀灭刚脱落的包囊的试验中,当过氧乙酸浓度为6.250、3.125、1.562mg/L时,包囊死亡率依次为75.63%、45.60%、25.60%.显著高于对照组:但当过氧乙酸浓度为0.780、0.390mg/L时,包囊死亡率和对照组没有显著差异。在杀灭脱落2h的包囊的试验中,当过氧乙酸浓度为6.250、3.125、1.562mg/L时,包囊死亡率依次为64.23%、46.32%、20.20%,显著高于对照组:但当过氧乙酸浓度为0.780、0.390mg/L时,包囊死亡卒和对照组没有显著差异。在杀灭脱落10h的包囊的试验中,当过氧乙酸浓度为6.250、3.125mg/L时,包囊死亡率分别为65.86%、35.07%,显著高于对照组:但是与杀灭刚脱落的包囊和脱落2h的包囊不同的是,当过氧乙酸浓度为1.562mg/L时,包囊死亡率与对照组并没有显著差异。过氧乙酸在低浓度(0.390、0.780mg/L)时对刚刚脱落、脱落2h的包囊与脱落10h的包囊的杀灭效果没有显著差异;但当浓度为3.125、1.562mg/L时,刚脱落、脱落2h的包囊死亡率显著高于脱落10h的包囊。在所有对照组中,包囊都具有一定的天然死亡率。

  从过氧乙酸对主要养殖品种的急性毒性试验中可以看出,过氧乙酸对不同鱼的LC50和SC有一定不同,其中对斑点叉尾鮰的毒性最强,而对草鱼、鲫鱼、奥尼罗非鱼的毒性相近,其原因可能是斑点叉尾鮰是一种无鳞的鱼类,对药物更敏感,因此在使用过氧乙酸时须更慎重。

  在过氧乙酸杀灭小瓜虫幼虫的试验中,当过氧乙酸浓度在1.562mg/L时,即能在lh内杀灭全部的幼虫,而1.562mg/L低于斑点叉尾鮰、草鱼、鲫鱼、奥尼罗非鱼的安全浓度;当过氧乙酸浓度为6.250mg/L时,能够在0.5h内将幼虫全部杀死;但是,当过氧乙酸浓度为3.125、1.562mg/L时,0.5h内并不能将幼虫全部杀死,而随着浸泡时间延长至1h才能够将幼虫全部杀死。这说明过氧乙酸对小瓜虫的杀灭效果具有一定的时间和浓度依赖性。而研究发现,油麻藤和番木瓜的粗提物与高铁酸钾对小瓜虫的杀灭效果也具有时间和剂量依赖性。

  在过氧乙酸对不同发育阶段包囊的杀灭试验中,当浓度为1.562mg/L时,对刚脱落的包囊和脱落2h的包囊的死亡率分别为25.60%和20.20%,均显著高于对照组。但是与浓度为1.562mg/L时能够杀死全部幼虫不同,说明幼虫对药物的抵抗力要低于包囊,这与小瓜虫幼虫对过碳酸钠、大蒜提取物和高铁酸钾的抵抗力要诋于包囊的结论一致。当浓度为3.125、1.562mg/L时,刚脱落、脱落2h的包囊的死亡率显著高于脱落10h的包囊的死亡率,说明脱落10h的包囊比刚脱落、脱落2h的包囊对过氧乙酸的抗药性更强,这与高铁酸钾的试验结果类似。

  在试验中观察到,脱落10h的包囊已经形成了多层结构的囊壁且正在进行分裂,可能导致包囊对过氧乙酸的抗性更强。

  本试验结果表明,过氧乙酸在4种鱼的安全浓度范围内对小瓜虫的幼虫和包囊都具有很好的杀灭效果,因此过氧乙酸在生产上防治小瓜虫具有广阔的应用前景。今后需要进一步加强过氧乙酸的稳定性研究以及在不同温度下药物对鱼类安全性和对小瓜虫杀灭效果的研究。

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